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上海市血液中心开发环介导等温扩增技术血液核酸筛检试剂

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【概要描述】上海市血液中心开发环介导等温扩增技术血液核酸筛检试剂环介导等温扩增血液核酸筛检试剂的开发2003年8月,上海市科委资助了上海市血液中心王迅申报的《环介导等温扩增血液核酸筛检试剂的开发》研究项目,虽然资助金额只有11万元人民币,但启明星项目重在以科研课题带动人才培养,许多如今活跃在上海科研工作第一线的学科带头人、专家和教授,当年都曾经从启明星项目中获得他们科研生涯中的第一桶金,为今后的发展奠定了基础

上海市血液中心开发环介导等温扩增技术血液核酸筛检试剂

【概要描述】上海市血液中心开发环介导等温扩增技术血液核酸筛检试剂环介导等温扩增血液核酸筛检试剂的开发2003年8月,上海市科委资助了上海市血液中心王迅申报的《环介导等温扩增血液核酸筛检试剂的开发》研究项目,虽然资助金额只有11万元人民币,但启明星项目重在以科研课题带动人才培养,许多如今活跃在上海科研工作第一线的学科带头人、专家和教授,当年都曾经从启明星项目中获得他们科研生涯中的第一桶金,为今后的发展奠定了基础

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上海市血液中心开发环介导等温扩增技术血液核酸筛检试剂

环介导等温扩增血液核酸筛检试剂的开发

2003 年 8 月,上海市科委资助了上海市血液中心王迅申报的《环介导等温扩增血液核酸筛检试剂的开发》研究项目,虽然资助金额只有 11 万元人民币,但启明星项目重在以科研课题带动人才培养,许多如今活跃在上海科研工作第一线的学科带头人、专家和教授,当年都曾经从启明星项目中获得他们科研生涯中的第一桶金,为今后的发展奠定了基础。因此启明星项目对青年科研工作者来说意义重大。虽然我中心每年都有人申报该项目,但此次是我中心历年来第一个获得启明星项目资助的课题。该课题将研究方向直指当前血液安全实践中的急需解决的问题,内容简介如下:

酶免检测的窗口期漏检是当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈。所谓窗口期,是指从感染病原开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段时间。不同的检测方法针对同一种病原有不同的窗口期,处于窗口期的病人具有传染性,但用这种检测方法无法检测到其病原标志物。酶免检测的窗口期比较长,已知 HCV 抗体检测的窗口期平均为 70 天, HIV 抗体检测的窗口期平均为 22 天,而HBsAg 则为 56 天。故酶免检测的窗口期漏检几乎不可避免。 1995 ~ 1998 年间,上海市血液中心开展的输血后肝炎的流行病学调查结果表明,上海地区输血后丙型肝炎的发病率为 0.6% ,且所发现的 2 例输血后丙型肝炎患者均为输用 HCV 抗体检测窗口期血液而引起。同样,上海市血液中心最近刚刚完成的上海地区血液安全性评价的研究结果也表明,上海地区的血液安全性已经接近发达国家水平,酶免漏检率远远低于 10 万分之一,在严格的质量管理保障下,新发生的输血后肝炎几乎都是由窗口期漏检所引起。因此必须在血液筛检体系中引入新的筛检方法,大幅度地缩短检测窗口期,才能进一步提高血液安全性。

欧美国家的经验表明, NAT 应用于血液筛检能有效缩短 HCV 抗体检测窗口期 72% ,缩短 HIV-1 抗体检测窗口期 50% 。日本也报道使用 HBV DNA 的 NAT 血液筛检方法能进一步减少 HBsAg 的漏检。NAT 引入血液筛检,能大大缩短病毒检测的窗口期,提高血液安全性。 1999 年 3 月, Chiron 公司的 TMA 技术和 Roche 公司的 AmpliScreen 技术在美国 FDA 的新药审核程序下应用于血液筛检; 1999 年 7 月,欧洲医疗产品规范委员会( CPMP )也规定所有的血浆制品的原料、中试产品和最终产品都应进行 HCV PCR 检测; 2001 年 10 月,日本和法国将 NAT 技术运用于血液筛检; 2002 年 3 月和 2002 年 10 月在新药审核程序下试用了 2 年后,美国 FDA 正式批准 Chiron 公司的 TMA 技术和 Roche 公司的 AmpliScreen 技术运用与血液筛检。我国卫生行政部门也规定, 2003 年 1 月 1 日以后,所有血浆制品的原料浆在投产前,必须进行 NAT 检测。上海市血液中心在 2001 ~ 2002 年间,对 Chiron 公司的 TMA 技术在上海血液筛检中应用的可行性进行了评估,证明 NAT 技术在我国应用具有可行性,并能最大限度地提高我国的血液安全。

然而,进口 NAT 试剂高额的成本制约了我国血液常规 NAT 检测的开展。平均每单位血液增加 100 多元的检测费用,迫使卫生行政部门不得不在生命和经济之间作出艰难的选择。虽然将 PCR 技术运用于血液筛检早已被大多数国内生物科技企业关注,但经过多年的研发实践,国产 PCR 诊断试剂灵敏度仍然平均比 Chiron 和 Roche 的试剂要低 2 ~ 3 个数量级,特异性不高也使得其检测假阳性率较高。更重要的是,由于国产试剂均针对临床诊断需要而设计,操作复杂,无法质控,不适合大量样品的检测,而无法在常规血筛中应用。这一方面表明,走独立自主研发的道路,开发出适合我国血液筛检的,灵敏、特异、简便、经济的 NAT 试剂是进一步保障我国血液安全的迫切需要;另一方面揭示,只有及时运用生物技术发展的最新成果,克服 PCR 技术的局限,才能真正满足我国血液筛检的需要。

环介导等温扩增( Loop-mediated Isothermal Amplification)技术,是日本荣研化学独自开发的替代 PCR ( Polymerase Chain Reaction )的价廉、迅速、简便、准确的核酸检测( Nucleic Acid Testing, NAT )方法,已在世界范围内申请了技术专利。其特点是对靶基因的 6 个部位设定 4 种引物,利用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增。该方法适用于床边诊断和大量样品同时检测,值得在血液筛检等许多领域应用推广。由于此项技术刚刚建立起来,日本方面仅将该技术开发成牛胚性别诊断试剂推向市场,目前传染病检测领域尚无此技术开发的商业试剂。

本研究小组在了解了环介导等温扩增技术基本原理的第一时刻,即以敏锐的洞察力,发现了其在血液筛检领域的应用价值。 环介导等温扩增技术与 PCR 一样利用酶反应系统直接扩增靶核酸序列,能使靶核酸序列呈指数级扩增,故 环介导等温扩增技术能获得与 PCR 一样的灵敏度,能满足血液筛检对核酸检测方法上较高的灵敏度要求。在特异性方面,由于环介导的等温扩增技术通过 6 个不同部位的 4 对引物的相互作用来产生扩增效应,因此能获得比 PCR 更高的特异性,这对特异性也要求较高的血液筛检来说,也非常重要。另外, 环介导等温扩增技术实行的是等温扩增,省去了昂贵的热循环仪的费用,同时, 40 ~ 60 分钟即可完成扩增反应,也适应了血液筛检简便、快速、经济的特点。更为重要的是, 环介导等温扩增技术扩增反应体系要求 4 对引物完全匹配才能进行扩增,因此反应体系中的其他引物对反应的干扰很小, 环介导等温扩增技术较 PCR 更适合进行二合一或三合一反应,在血液筛检中应用不仅大大节约时间,而且还能大幅度缩减检测成本。经初步研究证明,运用环介导等温扩增技术检测 HBV 、 HCV 能达到 Roche Amplicor 相同的检测灵敏度。 HCV 和 HIV 二合一扩增体系也已初步建立,且其检测灵敏度和特异性均无较大改变,说明在二合一扩增体系中,不同的引物和靶序列之间相互干扰作用比较小。 环介导的等温扩增技术以其简便、经济、快速、灵敏和特异的特点,较 PCR 技术更适合在血液筛检中应用,开发出的环介导的等温扩增技术血液筛检试剂具有广阔的应用前景。

针对当前威胁我国血液安全的酶免检测的窗口期漏检的问题,本研究拟应用环介导等温扩增技术,开发出适合我国血液筛检常规工作的血液病毒核酸检测试剂,在研发过程中,有许多的新思想、新技术是以前的商业试剂所没有的,课题组在加紧研发的同时,还对这些新思想、新技术正在申请专利保护。该研究项目预期 1 ~ 2 年内即可完成,并立即进行成果转化。在不久的将来,我国血站将用上我国自主研发的高度灵敏和特异的,并且低成本的核酸检测试剂,进一步保障全国的血液安全。

本文转载于上海市(红十字)血液中心,原文地址:http://www.sbc.org.cn/modules/article2/view.article.php?158

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